1　主题内容与适用范围

　　本标准规定了用分光光度计测定各类动物性食品中胆固醇的方法。

　　本标准适用于各类动物性食品中胆固醇的测定。
            
  　2　原理

  　当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质。因此可先对食品样品进行提取和皂化，用硫酸铁铵试剂作为显色剂，测定食品中胆固醇的含量。

　　3　试剂

　　全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

 　 3.1　石油醚。

 　 3.2　无水乙醇。

    3.3　浓硫酸。

 　 3.4　冰乙酸：优级纯。

 　 3.5　磷酸。

    3.6　胆固醇标准物质。

 　 3.7　胆固醇标准液。

 　 3.7.1　胆固醇标准储备液(1mg/mL)：精确称取胆固醇100mg，溶于冰乙酸中，并定容至100mL。此液至少在2个月内保持稳定。

 　 3.7.2　胆固醇标准常备液(100μg/mL)：吸取胆固醇标准储备液10mL，用冰乙酸定容至100mL。此液用时临时配制。

 　 3.8　铁矾显色剂。

 　 3.8.1　铁矾储备液：溶解4.463g硫酸铁铵［FeNH4(SO4)2·H2O］于100mL85%磷酸中，贮于干燥器内，此液在室温中稳定。

 　 3.8.2　铁矾显色液：吸取铁矾储备液10mL，用浓硫酸定容至100mL。贮于干燥器内，以防吸水。

 　 3.9　50%氢氧化钾溶液：称取50g氢氧化钾，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。

 　 3.10　5%氯化钠溶液：称取5g氯化钠，用蒸馏水溶解，并稀释至100mL。

 　 3.11　钢瓶氮气：纯度99.99%。

 　 4　仪器和设备

 　 4.1　实验室常用设备。

 　 4.2　721型分光光度计。

 　 4.3　电热恒温水浴。

 　 4.4　电动振荡器。

 　 4.5　具玻塞试管：体积10mL、25mL。

    5　操作步骤

 　 5.1　胆固醇标准线

　　吸取胆固醇标准常备液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分别置于10mL试管内，在各管内加入冰乙酸使总体积皆达4mL。沿管壁加入2mL铁矾显色液，混匀，在15～90min内，在560～575nm波长下比色。以胆固醇标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线。

 　 5.2　样品测定

 　 5.2.1　食品脂肪的提取与测定

　　根据食品种类分别用索氏脂肪提取法、研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。并计算出每100g食品中的脂肪含量。

　　5.2.2　食品胆固醇的测定

　　将提取的油脂3～4滴(约含胆固醇300～500μg)，置于25mL试管内，准确记录其重量。加入4mL无水乙醇，0.5mL 50%氢氧化钾溶液，在65℃恒温水浴中皂化1h。皂化时每隔20～30min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出试管，冷却。加入3mL  5%氯化钠溶液，10mL石油醚，盖紧玻塞，在电动振荡器上振摇2min，静置分层(一般约需1h以上)。

　　取上层石油醚液2mL，置于10mL具玻塞试管内，在65℃水浴中用氮气吹干，加入4mL冰乙酸，2mL铁矾显色液，混匀，放置15min后在560～575nm波长下比色，测得吸光度，在标准曲线上查出相应的胆固醇含量。

  　6　结果计算

　　7　平均允许误差

　　同一实验室同时或连续两次测定结果之差不得超过平均值的10%。